ساخت کیت اندازه گیری هورمون تیروکسین آزاد ( free t4)در خون به روش رادیوایمنواسی

رادیوایمونواسی یا به اختصارria، یکی از روشهای بسیار حساس و اختصاصی برای اندازه گیری هورمون ها ، پروتئین ها و حتی متابولیت های دارویی که غلظت بسیار پائینی در خون دارند (از میکروگرم تا پیکوگرم ) می باشد. روش مزبور در اوایل دهه60 میلادی،جداگانه توسط پروفسور راجر اکینز در انگلستان و دکتر سالمون برسون و دکتر روزالین یالو در امریکا ابداع گردید. دو دانشمند اخیر اولین مقاله را در این زمینه ارائه دادند که در مورد اندازه گیری هورمون انسولین درخون بود وچند سال بعد به خاطر این کشف عظیم موفق به اخذ جایزه نوبل در پزشکی گردیدند.در این پایان نامه، نحوه تهیه کیت ria برای هورمون تیروکسین آزاد ( تیروکسینی که به پروتئین های خون اتصال ندارد) به روش هم پوشانی روی فاز جامد شرح داده شده است. هورمون تیروکسین آزاد ( ft4) به عنوان هورمون اصلی غده تیروئید با وزن مولکولی 777 دالتون می باشد. اختلالات غده تیروئید از شایع ترین بیماریهای غدد داخلی بدن میباشد و تعیین مقدار تیروکسین آزاد سرم یکی از مهمترین آزمایشات برای تعیین وضعیت غده تیروئید می باشد.اساس آزمایش به این صورت می باشد: « هورمون t4 که اصطلاحاً آنتی ژن ((ag نامیده می شود با ید رادیواکتیو ( 125i) نشاندار شده و با هورمون t4 غیر نشاندار برای اتصال با مقدار محدود آنتی بادی ( ab) ، با یکدیگر رقابت می کنند و کمپلکس های ag-ab و *ag-ab را تشکیل می دهند ( در اینجا ag همان t4 غیر نشاندار می باشد و *ag بیانگر t4 نشاندار با 125i است ).در پایان زمان انکوباسیون آزمایش ، کمپلکس های فوق به جدار لوله های پلی استیرنی اتصال پیدا می کنند که پس از دور ریختن محلول روئی ، می توانیم آنها را در دستگاه گاماکانتر شمارش و با استفاده از منحنی استاندارد، مقادیر نامعلوم (نمونه های ft4 بیماران )را تعیین مقدار کنیم.اجزاء یک کیت رادیوایمونواسی ft4 ، شامل شده اند از : - محلول هورمون t4 نشاندار با 125i . - انتی بادی بر علیه هورمون t4 که بر روی فاز جامد پوشش داده شده است . - استانداردهای مختلف با مقادیر مشخص ازغلظت آنالیت ( از صفر تا بالاترین مقدار از هورمون ( t4. دراین تحقیق انجام شده ، از روش کلرآمین-t که یک اکسید کننده قوی می باشد برای تبدیل یون ید منفی(i)به یدونیوم (i مثبت), جایگزینی آن به جای اتم هیدروژن در حلقه تیروزیل هورمون تیروکسین ، استفاده می شود . سپس برای خلوص هورمون نشاندار شده از کروماتوگرافی سفادکس ( g-25)استفاده می کنیم . در پایان این مرحله ، هورمون نشاندار خالص شده را رقیق می نمائیم (در حد 10 میکرو کوری برای هر کیت) . آنتی بادی آغشته شده به لوله های پلی استیرنی ، از اجزای بعدی کیت می باشد که برای این کار نیاز به تهیه آنتی بادی میباشد . برای این منظور هورمون تیروکسین را با آلبومین ترکیب می کنیم (conjugation)تا وزن مولکولی ای ترکیب بالا رفته و یک ایمنوژن قوی باشد و بتواند موقع تزریق به حیوان آزمایشگاهی (خرگوش) سیستم ایمنی آن را تحریک کرده و آنتی بادی بهتری را تولید کند . پس از چند تزریق متوالی ، خرگوشی که بالاترین تیتر آنتی بادی را تولید کرده بود ، انتخاب و از آن خونگیری به عمل می آید . در مرحله بعدآنتی بادی مزبور روی لوله های پلی استیرنی هم پوشانی یا آغشته (coating ) می گردد . آخرین معرف کیت ، استانداردهای آن می باشد که غلظت های متفاوت ( ازصفر تا بالاترین مقدار لازم ) را شامل می شود و برای تهیه آن ابتدا از پودر هورمون تیروکسین ، یک محلول غلیظ از هورمون مزبور را تهیه نموده و سپس با استفاده از اسپکترومتریuv مقدارصحت غلظت آن را کنترل می نمائیم . در صورت صحت غلظت ، با استفاده از رقیق سازی متوالی ، استانداردهای مورد نیاز در کیت را تهیه می کنیم . در آخرین مرحله ، کیت ساخته شده را مورد آزمایش قرار می دهیم که نتایج بدست آمده از کیت ،در مقایسه با کیت مشابه خارجی ، نشان داد که کیت ساخته شده از دقت وصحت لازم برخوردار می باشد.